口腔醫(yī)學(xué)院張芳團(tuán)隊(duì)研究乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)口腔扁平苔蘚炎性反應(yīng)的作用
山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院和山西醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室合作,，通過(guò)收集口腔扁平苔蘚患者的黏膜組織和體外培養(yǎng)人口腔黏膜角質(zhì)細(xì)胞局部模擬人口腔扁平苔蘚炎性環(huán)境,，從體內(nèi)和體外兩方面研究乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑對(duì)口腔扁平苔蘚炎性反應(yīng)的作用,。研究成果以“Role of mammary serine protease inhibitor on the inflammatory response in oral lichen planus”為題在線(xiàn)發(fā)表于1月24日的《口腔疾病》（Oral diseases）,。
口腔扁平苔蘚（OLP）是一種慢性炎癥性疾病,，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚,。IκB激酶α（Ikkα）調(diào)節(jié)的乳腺絲氨酸蛋白酶抑制劑（MASPIN）已被證明參與了慢性炎癥過(guò)程,，但MASPIN對(duì)OLP慢性炎性反應(yīng)的作用尚不清楚,。因此,，本研究的目的是探討MASPIN在OLP中的表達(dá)及其在炎癥反應(yīng)中的作用,。
本研究利用免疫組化染色和Real-time PCR分別檢測(cè)OLP及健康對(duì)照組中MASPIN、Ikkα的亞細(xì)胞定位和表達(dá)情況,；ELISA比較OLP及健康對(duì)照組中炎性細(xì)胞因子（TNF-α,，IL-6）的水平。LPS刺激人口腔角質(zhì)細(xì)胞（HOKs）部分模擬OLP炎性環(huán)境,，隨后進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),，轉(zhuǎn)染MASPIN質(zhì)粒和IKKα siRNA，利用Real-time PCR和Western Blot,、ELISA分別檢測(cè)MASPIN過(guò)表達(dá),、IKKα沉默后LPS刺激的HOKs中MASPIN、IKKα及炎性細(xì)胞因子的mRNA和蛋白表達(dá),。
本研究認(rèn)為過(guò)表達(dá)MASPIN或沉默IKKα可能緩解LPS引起的炎性反應(yīng),，推測(cè)MASPIN及IKKα可能參與并影響了OLP的發(fā)生發(fā)展，這為OLP的發(fā)病機(jī)制及藥物治療提供新的研究思路,。
OLP病損中MASPIN表達(dá)降低,，IKKα和炎性細(xì)胞因子表達(dá)升高
免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示MASPIN和IKKα在OLP組織中均呈陽(yáng)性表達(dá)。其中MASPIN主要定位在OLP上皮層的胞質(zhì)中,。雖然IKKα在HC組織中不表達(dá),，但I(xiàn)KKα表達(dá)于OLP病損上皮層，細(xì)胞質(zhì)亦是IKKα主要的定位部位（圖1a）,，Real-time PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,，同HC組相比，MASPIN在OLP組中低表達(dá),，而IKKα在OLP組中高表達(dá)（圖1b）,。這些結(jié)果表明MASPIN和IKKα均參與了OLP的發(fā)病機(jī)制,，且MASPIN和IKKα在OLP的炎癥環(huán)境中可能是負(fù)相關(guān)關(guān)系。同時(shí)ELISA結(jié)果顯示OLP組中TNF-α和IL-6的水平顯著升高（圖2）,。
圖1不同組織中MASPIN及IKKα的定位表達(dá)情況
圖2不同組織中TNF-α和IL-6的表達(dá)情況
LPS刺激HOKs成功誘導(dǎo)了口腔炎性環(huán)境
使用不同濃度的LPS刺激HOKs24h,，CCK-8和ELISA實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HOKs的增殖及炎性細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6）表達(dá)情況,，結(jié)果顯示10μg/ ml的LPS為刺激HOKs的最佳濃度,，成功誘導(dǎo)了口腔炎性環(huán)境（圖3）。
圖3 LPS刺激HOKs成功誘導(dǎo)口腔炎性環(huán)境
MASPIN過(guò)表達(dá)抑制了HOKs中IKKα和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)
MASPIN質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功后24h加入LPS,，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h,，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞總RNA,、蛋白及上清,，進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn)、Western Blot實(shí)驗(yàn)及ELISA實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明過(guò)表達(dá)MASPIN基因能夠抑制LPS刺激的HOKs中IKKα和炎性細(xì)胞因子TNF-α,，IL-6的基因和蛋白表達(dá)。
圖4 MASPIN過(guò)表達(dá)抑制IKKα和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)
IKKα沉默促進(jìn)了HOKs中MASPIN表達(dá),，抑制了炎性細(xì)胞因子的分泌
使用同樣的方法成功轉(zhuǎn)染IKKα siRNA后24h加入LPS,，于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞,，提取細(xì)胞總RNA,、蛋白及上清，進(jìn)行Real-time PCR實(shí)驗(yàn),、Western Blot實(shí)驗(yàn)及ELISA實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)相關(guān)基因和蛋白的表達(dá),，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明沉默IKKα基因能夠抑促進(jìn)LPS刺激的HOKs中MASPIN表達(dá)、抑制TNF-α和IL-6的表達(dá),。
圖5IKKα沉默促進(jìn)MASPIN表達(dá),、抑制炎性細(xì)胞因子表達(dá)
山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院研究生徐娜為第一作者，山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院黏膜科主任張芳副教授為通信作者,。該研究項(xiàng)目得到了山西醫(yī)科大學(xué)博士啟動(dòng)基金和山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院科技創(chuàng)新基因的支持,。
