黨參均一多糖CPA在Caco-2單層及小鼠體內(nèi)的入胞機(jī)制及轉(zhuǎn)運(yùn)特點(diǎn)研究
黨參為桔?？浦参稂h參 Codonopsis pilosula (Franch) Nannf,、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf． var． modesta (Nannf) L.T.Shen 或川黨參 Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根,，具有補(bǔ)中益氣,、健脾益肺的功效。臨床主要用于脾肺虛弱,，氣短心悸,，食少便溏,，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消渴等癥狀,。作為大宗藥材,，國內(nèi)黨參每年的消耗量約3.5噸。據(jù)2020版藥典記載,，約10%的中藥方劑中含有黨參,，可謂“無參不成方”。依據(jù)黨參的不同產(chǎn)區(qū)將黨參分為臺黨（山西五臺山）,，潞黨（山西長治）,，東黨（中國東北），條黨（中國四川）,。太行山位于華北平原和山西黃土高原之間,，其特殊的地理位置和氣候條件，為黨參生長提供了得天獨(dú)厚的生態(tài)優(yōu)勢,，《本草從新》曾記載：“參須上黨者佳”,，太行山所產(chǎn)潞黨參品質(zhì)極佳，被認(rèn)為是黨參的道地產(chǎn)區(qū),。
潞黨參為山西傳統(tǒng)道地藥材，多糖含量是反映潞黨參道地品質(zhì)的重要質(zhì)量指標(biāo),，而果聚糖是黨參多糖的主要成分,，也是黨參的主要藥理活性物質(zhì)。課題組前期從黨參多糖中分離出菊粉型果聚糖CPA,，核磁和TOF-MS結(jié)構(gòu)解析顯示CPA分子量約為3.6 KDa,，聚合度為31，動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示黨參多糖CPA對潰瘍性結(jié)腸炎,、胃潰瘍等疾病有很好的干預(yù)作用,，被認(rèn)為是一種植物來源的有廣闊應(yīng)用前景的新藥候選分子。但是,，作為大分子多糖,，CPA化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，缺少光吸收和光發(fā)色基團(tuán),，沒有特定的紫外吸收光譜,，常規(guī)的檢測器難以對其檢測分析，很難在生物樣本中實(shí)現(xiàn)定量檢測,。課題組前期發(fā)現(xiàn)CPA在腸道組織中分布較少,，CPA良好的治療作用與其吸收入胞有關(guān)嗎？CPA是否可以吸收入胞,？是通過什么途徑進(jìn)入細(xì)胞的,？等問題尚不清楚,。
因此，為明確CPA能否入胞及其機(jī)制研究,，山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院高建平教授團(tuán)隊(duì),，在Caco-2 細(xì)胞及小鼠體內(nèi)進(jìn)行了研究，首先選取臨床常用熒光染料異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate isomer,，FITC）作為熒光劑對CPA進(jìn)行了標(biāo)記,，通過FTIR，UV以及HPGPC對產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定,。利通激光總聚焦顯微鏡直觀考察了CPA能否入胞,，采用流式細(xì)胞儀考察了CPA的入胞特點(diǎn)，并進(jìn)行了入胞機(jī)制的研究,；最后在小鼠體內(nèi)考察了CPA的藥代動力學(xué)特征以及組織分布特點(diǎn),。本研究提供了CPA內(nèi)化和轉(zhuǎn)運(yùn)的相關(guān)理論知識，為黨參多糖的臨床應(yīng)用提供了理論依據(jù),。該研究成果于2022年8月31日在《International Journal of Biological Macromolecules》（IF=8.02）上以“Investigation of the internalization and transport mechanism of Codonopsis Radix polysaccharide both in mice and Caco-2 cells”為題在線發(fā)表,。
該研究結(jié)果顯示：
1. 本部分研究探討了FCPA的入胞機(jī)制，分別用巨胞飲,、小窩蛋白依賴性,、網(wǎng)格蛋白依賴性、網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴性抑制劑抑制相關(guān)蛋白,，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F-NH-CPA主要通過網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴性途徑進(jìn)入細(xì)胞,；使用溶酶體、微管蛋白抑制劑后,，F-NH-CPA的胞內(nèi)攝取量減少,，表明溶酶體、微管蛋白參與了F-NH-CPA的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn),。
圖1 FCPA的入胞特點(diǎn)
2.本部分研究模擬腸上皮細(xì)胞構(gòu)建了Caco-2單層細(xì)胞模型,，通過激光共聚焦顯微鏡直觀考察CPA的胞內(nèi)攝取，并通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行定量分析,。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中均有FCPA的熒光信號,，表明FCPA可以被吸收進(jìn)入細(xì)胞；進(jìn)一步用流式細(xì)胞儀進(jìn)行半定量研究,，發(fā)現(xiàn)FCPA進(jìn)入細(xì)胞具有時間,、濃度依賴性。用Transwell小板構(gòu)建的Caco-2單層細(xì)胞明確FCPA的攝取能力,，結(jié)果表明FCPA吸收較差,，只有較少的FCPA能進(jìn)入細(xì)胞。
圖2 FCPA的入胞機(jī)制
3. FCPA可以吸收入血,，達(dá)峰時間較快,，約為1 h,，且在6 h出現(xiàn)了雙峰。T1/2較短,，為5.39 ± 1.73 h,，CL/F為5.73 ± 3.09 L h-1 kg-1；平均滯留時間MRT為9.44 ± 2.73,，其表觀分布容積Vd/F為41.89 ± 12.42 L kg-1,，藥時曲線下面積AUC(0→∞)為11.36 ± 3.80 mg L-1 h-1，表明FCPA在小鼠體內(nèi)分布廣泛,，滯留時間較長,，消除較慢，不能迅速轉(zhuǎn)移到外周組織或隨尿液排出,。FCPA可廣泛分布到肝,、腎、肺,、胃,、腸道等組織，組織濃度相當(dāng)或者略高于同時間點(diǎn)血漿濃度,，但整體濃度較低,。
圖3 FCPA的藥代動力學(xué)及組織分布研究
藥學(xué)院高建平教授為本文的通訊作者，藥學(xué)院2019級博士研究生邵云云為本文的第一作者,。該研究項(xiàng)目得到國家重大專項(xiàng)（2019YFC1710800 and 2019YFC1710801）的資助,。
