黨參均一多糖CPA在Caco-2單層及小鼠體內(nèi)的入胞機制及轉(zhuǎn)運特點研究
黨參為桔梗科植物黨參 Codonopsis pilosula (Franch) Nannf、素花黨參Codonopsis pilosula Nannf． var． modesta (Nannf) L.T.Shen 或川黨參 Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根，具有補中益氣、健脾益肺的功效。臨床主要用于脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消渴等癥狀。作為大宗藥材，國內(nèi)黨參每年的消耗量約3.5噸。據(jù)2020版藥典記載，約10%的中藥方劑中含有黨參，可謂“無參不成方”。依據(jù)黨參的不同產(chǎn)區(qū)將黨參分為臺黨（山西五臺山），潞黨（山西長治），東黨（中國東北），條黨（中國四川）。太行山位于華北平原和山西黃土高原之間，其特殊的地理位置和氣候條件，為黨參生長提供了得天獨厚的生態(tài)優(yōu)勢，《本草從新》曾記載：“參須上黨者佳”，太行山所產(chǎn)潞黨參品質(zhì)極佳，被認為是黨參的道地產(chǎn)區(qū)。
潞黨參為山西傳統(tǒng)道地藥材，多糖含量是反映潞黨參道地品質(zhì)的重要質(zhì)量指標，而果聚糖是黨參多糖的主要成分，也是黨參的主要藥理活性物質(zhì)。課題組前期從黨參多糖中分離出菊粉型果聚糖CPA，核磁和TOF-MS結(jié)構解析顯示CPA分子量約為3.6 KDa，聚合度為31，動物實驗結(jié)果顯示黨參多糖CPA對潰瘍性結(jié)腸炎、胃潰瘍等疾病有很好的干預作用，被認為是一種植物來源的有廣闊應用前景的新藥候選分子。但是，作為大分子多糖，CPA化學結(jié)構復雜，缺少光吸收和光發(fā)色基團，沒有特定的紫外吸收光譜，常規(guī)的檢測器難以對其檢測分析，很難在生物樣本中實現(xiàn)定量檢測。課題組前期發(fā)現(xiàn)CPA在腸道組織中分布較少，CPA良好的治療作用與其吸收入胞有關嗎？CPA是否可以吸收入胞？是通過什么途徑進入細胞的？等問題尚不清楚。
因此，為明確CPA能否入胞及其機制研究，山西醫(yī)科大學藥學院高建平教授團隊，在Caco-2 細胞及小鼠體內(nèi)進行了研究，首先選取臨床常用熒光染料異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate isomer，FITC）作為熒光劑對CPA進行了標記，通過FTIR，UV以及HPGPC對產(chǎn)物進行了鑒定。利通激光總聚焦顯微鏡直觀考察了CPA能否入胞，采用流式細胞儀考察了CPA的入胞特點，并進行了入胞機制的研究；最后在小鼠體內(nèi)考察了CPA的藥代動力學特征以及組織分布特點。本研究提供了CPA內(nèi)化和轉(zhuǎn)運的相關理論知識，為黨參多糖的臨床應用提供了理論依據(jù)。該研究成果于2022年8月31日在《International Journal of Biological Macromolecules》（IF=8.02）上以“Investigation of the internalization and transport mechanism of Codonopsis Radix polysaccharide both in mice and Caco-2 cells”為題在線發(fā)表。
該研究結(jié)果顯示：
1. 本部分研究探討了FCPA的入胞機制，分別用巨胞飲、小窩蛋白依賴性、網(wǎng)格蛋白依賴性、網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴性抑制劑抑制相關蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)F-NH-CPA主要通過網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白非依賴性途徑進入細胞；使用溶酶體、微管蛋白抑制劑后，F-NH-CPA的胞內(nèi)攝取量減少，表明溶酶體、微管蛋白參與了F-NH-CPA的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運。
圖1 FCPA的入胞特點
2.本部分研究模擬腸上皮細胞構建了Caco-2單層細胞模型，通過激光共聚焦顯微鏡直觀考察CPA的胞內(nèi)攝取，并通過流式細胞儀進行定量分析。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞膜和細胞質(zhì)中均有FCPA的熒光信號，表明FCPA可以被吸收進入細胞；進一步用流式細胞儀進行半定量研究，發(fā)現(xiàn)FCPA進入細胞具有時間、濃度依賴性。用Transwell小板構建的Caco-2單層細胞明確FCPA的攝取能力，結(jié)果表明FCPA吸收較差，只有較少的FCPA能進入細胞。
圖2 FCPA的入胞機制
3. FCPA可以吸收入血，達峰時間較快，約為1 h，且在6 h出現(xiàn)了雙峰。T1/2較短，為5.39 ± 1.73 h，CL/F為5.73 ± 3.09 L h-1 kg-1；平均滯留時間MRT為9.44 ± 2.73，其表觀分布容積Vd/F為41.89 ± 12.42 L kg-1，藥時曲線下面積AUC(0→∞)為11.36 ± 3.80 mg L-1 h-1，表明FCPA在小鼠體內(nèi)分布廣泛，滯留時間較長，消除較慢，不能迅速轉(zhuǎn)移到外周組織或隨尿液排出。FCPA可廣泛分布到肝、腎、肺、胃、腸道等組織，組織濃度相當或者略高于同時間點血漿濃度，但整體濃度較低。
圖3 FCPA的藥代動力學及組織分布研究
藥學院高建平教授為本文的通訊作者，藥學院2019級博士研究生邵云云為本文的第一作者。該研究項目得到國家重大專項（2019YFC1710800 and 2019YFC1710801）的資助。
